Qué información proporciona la secuenciación del genoma del coronavirus SARS-CoV-2

 Conoce a tu enemigo. La conocida frase del famoso tratado de estrategia “El Arte de la guerra” adquiere un carácter esencial frente al nuevo agente microscópico que amenaza la salud de miles de personas y pone a prueba la organización y sistemas sanitarios de múltiples países: el coronavirus SARS-CoV-2.

Una de las mejores formas de conocer un organismo, es secuenciar su genoma, que contiene las instrucciones necesarias para hacerlo funcionar. Cuando se produce una pandemia como la de COVID-19, conocer el genoma del agente infeccioso responsable proporciona información con gran relevancia para los investigadores. Les permite identificar qué es lo que causa la enfermedad, conocer su origen y evolución con el tiempo o desarrollar estrategias terapéuticas para hacerle frente.

 

Identificación de SARS-CoV-2

La primera secuencia del genoma del agente infeccioso responsable de la epidemia iniciada en Wuhan se obtuvo en enero. Esta información fue crítica para identificar al virus como un coronavirus, muy similar al coronavirus responsable del Síndrome Agudo Respiratorio Grave (SARS en sus siglas en inglés), enfermedad respiratoria originada en Asia en 2003, que se propagó por diversos países. Los coronavirus son virus de ARN que se reciben su nombre por la característica estructura de su forma infectiva, similar a la corona solar. Este tipo de virus es responsable de muchos de los resfriados comunes, que no tienen consecuencias importantes sobre la salud. No obstante, otros pueden causar enfermedades mortales como el SARS o el  síndrome respiratorio de oriente medio (MERS en sus siglas en inglés).

La similitud del nuevo coronavirus con el virus responsable del SARS, denominado SARS-CoV, fue determinante para denominar al nuevo virus SARS-CoV-2.

 

Estructura general del coronavirus SARS-CoV2. Imagen: Alissa Eckert, MS; Dan Higgins, MAMS, Centers for Disease Control and Prevention.

Características del nuevo coronavirus

El análisis del genoma de SARS-CoV-2, en combinación con las pruebas bioquímicas y las imágenes obtenidas por microscopía electrónica, permite conocer mejor sus características, incluyendo aquellas que pueden ser aprovechadas por los investigadores para desarrollar terapias.  Así, a partir de pruebas bioquímicas y estructurales los investigadores han determinado que la parte más variable del genoma del coronavirus se encuentra precisamente en el dominio de unión al receptor de la proteína S, una proteína necesaria para la invasión del virus. En humanos, este dominio proteico tiene una afinidad especial por los receptores ACE2 de las células del hospedador.

Cuando los coronavirus infectan una célula, liberan en su interior su ARN que puede ser leído por la maquinaria celular para producir una larga cadena polipeptídica que es posteriormente fragmentada en péptidos funcionales para el virus. Otra característica encontrada en el genoma de SARS-CoV-2 es que esa cadena polipeptídica presenta un fragmento en que facilita la separación de los péptidos correspondientes a la proteína S.

 

Origen del Coronavirus de Wuhan

Una de las cuestiones más discutidas sobre el coronavirus SARS-CoV-2 es su origen. Las primeras investigaciones apuntaban a un posible origen animal, sin que estuviera claro cuál era exactamente. La hipótesis más aceptada en la actualidad es que el virus deriva de un virus de murciélagos que pasó a nuestra especie a través de un intermediario, como ocurrió en el caso de los coronavirus responsables del SARS y del MERS.

En paralelo a los estudios científicos, también empezaron a surgir también diversas teorías sobre si el coronavirus había sido creado en un laboratorio y liberado intencionada o accidentalmente. Un reciente análisis, que considera la información disponible del genoma del virus, descarta la creación del virus y plantea los posibles escenarios de su evolución.

Los autores del análisis indican que es muy poco probable que SARS-CoV-2 haya sido creado a partir de la manipulación de otro coronavirus. La estructura del genoma de SARS-CoV-2  no deriva de la de otro virus, que sería lo que se esperaría si fuera de diseño. Además, aunque el dominio proteico de unión al receptor de la proteína S mencionado anteriormente tiene afinidad por los receptores ACE2 humanos, esta afinidad no está optimizada mediante predicciones. Es diferente de lo que los algoritmos predictivos estimarían.

Los investigadores plantean diversos escenarios posibles de aparición del SARS-CoV-2. En el primero de ellos, el virus habría adquirido sus características a través de la selección natural en una especie animal antes de que el virus saltara a la especie humana. Entre los datos que apoyarían esta posibilidad está el hecho de que la variación del dominio de unión de la proteína S encontrada en SARS-CoV-2 es similar a la observada en otros coronavirus encontrados en pangolines. Sin embargo, los coronavirus más cercanos a SARS-CoV-2 presentes en animales no tienen la secuencia que favorece fragmentación de péptidos de la proteína S.

En el segundo escenario, la selección natural en el virus se habría producido en humanos tras la transferencia del virus desde una especie animal. La adquisición de la secuencia de corte habría sido incorporada también una vez en la especie humana.

Un tercer escenario posible planteado por los investigadores es que los cambios en el genoma de SARS-CoV-2 respecto a otros virus (es decir, su origen) hayan ocurrido por accidente en cultivos celulares de investigación. Los autores del análisis no encuentran evidencias de que ese haya sido el caso e indican que no creen que este escenario sea plausible.  No obstante, señalan que con la información actual no se puede concluir de forma definitiva cuál de los tres escenarios es el correcto y será necesario investigar más.

 

Mapa filogenético de relaciones genéticas entre los genomas obtenidos de personas infectadas con SARS-CoV-2. Imagen tomada de Nexstrain.org.

 

Evolución del coronavirus y seguimiento de la enfermedad

La secuenciación de los genomas de los virus SARS-Cov-2 que se van aislando de las personas diagnosticadas como infectadas permite elaborar un registro de cómo va evolucionando el virus. Una característica de los virus de ARN como SARS-Cov-2 es que mutan rápidamente, y van acumulando cambios en su genoma. Registrar estos cambios es una herramienta epidemiológica muy útil para hacer el seguimiento de la infección.

Desde el inicio de la pandemia de COVID-19 los investigadores están compartiendo las secuencias de SARS-Cov-2 obtenidas en los diferentes países, lo que ha permitido elaborar un mapa dinámico de la evolución de SARS-Cov-2 que permite visualizar la progresión espacial y temporal del virus. Las primeras secuencias de los coronavirus aislados en España fueron incorporadas el pasado viernes, tras ser obtenidas por el Servicio de Secuenciación y Bioinformática de FISABIO y por el grupo de investigación en Epidemiología Molecular del I2SysBio, liderados por Fernando González-Candelas, catedrático de Genética de la Universitat de València.

Con la información proporcionada por los diferentes equipos, se sabe que el virus está mutando y que la tasa de mutación de SARS-Cov-2 es más lenta que la del virus de la gripe. Sin embargo, todavía no hay datos sobre si ha cambiado su virulencia. Conforme se obtengan más secuencias de más pacientes podrá mejorarse la resolución en el mapa de evolución del virus, y obtenerse más detalles.

 

Mapa de las transmisiones de SARS-CoV-2 a partir de la información obtenida de genomas de virus aislados de personas infectadas. Imagen: Nextstrain.org.

Diseño de terapias

En la actualidad, el objetivo final de todas las investigaciones sobre el coronavirus SARS-Cov-2 es encontrar una forma de detenerlo y  tratar a los pacientes. En este sentido conocer qué regiones del genoma del virus son más o menos susceptibles a tener mutaciones puede ser utilizado en el diseño de estrategias terapéuticas.

Por una parte, la similitud del genoma de SARS-Cov-2 con el del virus SARS-Cov-1 plantea la posibilidad de utilizar o adaptar estrategias que han mostrado potencial en SARS a la enfermedad causada por SARS-Cov-2. Por otra muchas de las aproximaciones para hacer frente a los virus dependen del reconocimiento de moléculas, bien ARN bien proteínas. En este sentido, interesará diseñar los agentes terapéuticos para que reconozcan moléculas con baja probabilidad de sufrir cambios.

 

En resumen, la secuenciación del genoma de SARS-Cov-2 es una herramienta esencial para estudiar la progresión y evolución del virus, así como para poder desarrollar tratamientos o vacunas para COVID-19.

 

 

Referencias:

Andersen KG, et al. The proximal origin of SARS-CoV-2. Nat Med. 2020. https://doi.org/10.1038/s41591-020-0820-9

Liu C, et al. Research and Development on Therapeutic Agents and Vaccines for COVID-19 and Related Human Coronavirus Diseases. ACS Cent Sci. 2020. Doi: https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c00272

Fuentes:

https://nextstrain.org/ncov

Las primeras secuencias genómicas del virus SARS-CoV-2 de dos pacientes españoles se han obtenido en València. https://www.uv.es/instituto-biologia-integrativa-sistemas-i2sysbio/es/novedades-1285990801509/Novetat.html?id=1286122919661

¿De qué sirve secuenciar el coronavirus? https://theconversation.com/de-que-sirve-secuenciar-el-coronavirus-133717

¿Cómo cambian los virus? https://theconversation.com/como-cambian-los-virus-132996

 Fuente: https://genotipia.com/genetica_medica_news/sars-cov/

Identificado un mecanismo que contribuye a explicar por qué los portadores de APOE4 tienen mayor riesgo al Alzhéimer

 Investigadores del Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) han descubierto un mecanismo por el que el gen APOE4 confiere un mayor riesgo de padecer Alzhéimer. En un estudio publicado en Science Translational Medicine muestran que APOE4 causa un desequilibrio del metabolismo lipídico en las células que altera su funcionamiento. Además, a partir de estudios en levadura y células humanas proponen a la colina como potencial tratamiento para restaurar el equilibrio lipídico y prevenir o frenar el desarrollo de la enfermedad en portadores de APOE4.

Pérdida de conexiones neriviosas entre las células de los pacientes con Alzhéimer. Imagen: Instituto Nacional de Envejecimiento (NIA), EEUU.

El Alzhéimer es la enfermedad neurodegenerativa más frecuente en la población. Es una enfermedad compleja en la que intervienen diferentes factores. Y dentro de los genéticos se ha visto que un alelo concreto del gen APOE supone un factor de riesgo frente al desarrollo de Alzhéimer.

El gen APOE codifica para la apolipoproteína E, una proteína transportadora de lípidos. Se conocen tres variantes del gen: APOE2, APOE3 y APOE4. Los individuos con APOE2 tienen menos posibilidades de sufrir Alzhéimer que el resto, mientras que la versión APOE3 es considerada neutral y la versión APOE4 (la presenta el 14% de la población) se asocia a un mayor riesgo de padecer Alzhéimer.

Aunque no se conoce el papel exacto de APOE4 en el desarrollo del Alzhéimer, se sabe que la apolipoproteína E participa en el metabolismo de lípidos por lo que APOE4 podría influir en desarrollo del Alzhéimer a través de ese proceso. Para investigar esta posibilidad y determinar las diferencias que se producen metabólicamente en las células según la variante de APOE los investigadores han realizado diferentes pruebas en levaduras y células humanas en cultivo.

En primer lugar, los investigadores utilizaron células madre pluripotentes inducidas, que compartían un mismo genoma con la excepción de que unas tenían APOE3 y las otras tenían APOE4. Las células que más APOE producen son los astrocitos por lo que diferenciaron las células madre a astrocitos. Los resultados obtenidos muestran que los astrocitos que presentaban la variante APOE4 sintetizaban una mayor cantidad de ácidos grasos insaturados que el resto, lo que llevaba a un desequilibrio lipídico en las células nerviosas.

Los investigadores observaron que, como se produce mayor cantidad de ácidos grasos de lo normal, las células no tienen una correcta homeostasis lipídica y esto afecta a varios procesos celulares como el tráfico vesicular, el tráfico intracelular, la endocitosis y la generación de membranas. El mantenimiento de la homeostasis es fundamental para que las células puedan afrontar el estrés.

A continuación, el equipo utilizó levaduras modificadas mediante técnicas genéticas. En este caso, el experimento consistió en expresar la versión humana del gen APOE4 para analizar en detalle y de forma exhaustiva las diferencias funcionales entre las células que presentan la variante APOE4 y las células que presentan otras variantes. A partir de los resultados obtenidos los investigadores llegaron a la conclusión de que las células que expresan APOE4 necesitan una mayor síntesis de fosfolípidos para funcionar correctamente. Además, comprobaron que la variante APOE4 causa alteraciones en el metabolismo de los lípidos por sí misma, independientemente del entorno celular.

Por otra parte, los investigadores han encontrado que, al cultivar las levaduras en medios ricos en colina, las células funcionaban mejor. La colina es un nutriente que se utiliza en la síntesis de membranas celulares, ya que es un componente de algunos fosfolípidos. Además, es la molécula precursora de la acetilcolina, un importante neurotransmisor.

Los resultados del trabajo indican que la colina tiene un efecto beneficioso en células que expresan APOE4, ya que ayuda a reestablecer la homeostasis lipídica y así se revierten los daños por estrés celular. Los investigadores plantean que aumentando el consumo de colina los individuos portadores del gen APOE4 podrían prevenir el desarrollo de Alzhéimer o incluso aminorar sus síntomas. De momento, han comprobado que la suplementación con colina restaura también la homeostasis de lípidos en astrocitos humanos con APOE4 obtenidos de células madre pluripotentes. Además, están trabajando en un modelo de ratón modificado genéticamente para expresar el gen APOE4 humano, para comprobar en él los efectos de la colina.

“Lo que realmente nos gustaría ver es si en la población humana, en los portadores de APOE4, si toman suplementos de colina en una cantidad suficiente, eso retrasaría o les daría protección frente al desarrollo de demencia o Alzhéimer”, dice el director del Instituto Picower del MIT, Li-Huei Tsai. La colina se puede encontrar de forma natural en distintos alimentos, pero como poca gente llega a consumir la cantidad mínima diaria recomendada, los portadores del APOE4 podrían recurrir a suplementos de colina para estar más protegidos frente al Alzhéimer. Por otra parte, en los individuos portadores de APOE2 o APOE3 la deficiencia en colina no aumenta la susceptibilidad a desarrollar Alzhéimer, “Lo que nuestros resultados sugieren es que si eres un portador de APOE2 o APOE3, incluso si presentas deficiencias en colina, lo puedes sobrellevar”, “Pero si eres portador de APOE4, entonces si no tomas suficiente colina, eso tendrá consecuencias más extremas. Los portadores de APOE4 son más susceptibles a la deficiencia en colina”, concluye el investigador Li-Huei Tsai.

Referencia: Sienski G, et al. APOE4 disrupts intracellular lipid homeostasis in human iPSC-derived glia. Science Translational Medicine. 2021. DOI: http://dx.doi.org/10.1126/scitranslmed.aaz4564

Fuente: Study offers an explanation for why the APOE4 gene enhances Alzheimer’s risk. https://news.mit.edu/2021/study-offers-explanation-why-apoe4-gene-enhances-alzheimers-risk

Fuente: Identificado un mecanismo que contribuye a explicar por qué los portadores de APOE4 tienen mayor riesgo al Alzhéimer

El código de las histonas: un lenguaje genético más allá del ADN

 

Mónica Martínez Adell, Genotipia

 Seguramente conoces el código genético, que recoge cómo a partir del ADN la información genética se expresa en forma de proteínas. ¿Sabías que éste no es el único código que existe en genética? Además de los ácidos nucleicos, las proteínas histonas también pueden codificar una determinada información y afectar a la expresión de los genes. Hablamos del código de las histonas.

Figura creada con Biorender.

En eucariotas el ADN está empaquetado y compactado en el núcleo celular. Esto se consigue gracias a la interacción entre el ADN y varias proteínas que forman la cromatina, una especie de fibra que se condensa para formar los cromosomas. La unidad fundamental de la cromatina es el nucleosoma, que consiste en un octámero de proteínas llamadas histonas, el ADN enrollado a su alrededor y otra histona que lo sujeta.

Niveles de compactación del ADN. En el cromosoma encontramos el máximo grado de condensación del ADN, donde la cromatina se encuentra lo más enrollada y compactada posible. Consiste en hebras de cromatina que forman bucles y se enrollan sobre sí mismas, de forma que una determinada longitud de hebras ocupa menos espacio. El nivel de más abajo es el llamado “collar de perlas”, en el que el ADN se enrolla alrededor de los nucleosomas. Es el nivel de menor condensación de la cromatina. Figura creada con Biorender.

Formación de los nucleosomas

Los nucleosomas se pueden ensamblar y desensamblar durante diferentes procesos celulares. Por ejemplo, para que pueda producirse la replicación del ADN las histonas deben separarse de él, para que la polimerasa y otras enzimas puedan acceder a todo el ADN.

Estructura tridimensional del nucleosoma. Se observan las ocho histonas formando el octámero (dos histonas H3, dos histonas H4, dos histonas H2A y dos histonas H2B), representadas de forma esférica y que tienen una cola terminal. El ADN se enrolla alrededor del octámero dando dos vueltas, 150 pares de bases aproximadamente. El ADN que queda sin enrollar, entre dos nucleosomas, se llama ADN espaciador y es de unos 80 pares de bases de longitud. Al fondo, en morado oscuro, está la histona H1, que mantiene unidos al ADN y al octámero de histonas. Figura creada con Biorender.

En la formación del nucleosoma, primero tiene lugar el ensamblaje de dos histonas H3 y dos histonas H4 para formar el tetrámero central. El ADN (150 pares de bases aproximadamente) se enrolla alrededor de ese tetrámero y luego se añaden dos dímeros formados por las histonas H2A y H2B cada uno. Finalmente, se une una histona H1, que mantiene al ADN sujeto alrededor del octámero.

Hasta ahora hemos visto el papel estructural de las histonas en la cromatina, pero también juegan un importante papel en la expresión génica. Hay dos tipos de cromatina: la eucromatina, que es transcripcionalmente activa, y la heterocromatina, que es transcripcionalmente inactiva. La heterocromatina está más condensada que la eucromatina, por lo que es más fácil acceder a la eucromatina y poder transcribir esos genes. Las histonas participan en la determinación del tipo de estructura de la cromatina. Por lo tanto regulan la expresión génica.

 

Modificaciones de las histonas

Las histonas pueden sufrir varios tipos de modificaciones (marcas epigenéticas), cada una de las cuales tiene un efecto diferente. Esas marcas influyen en el estado de la cromatina y por tanto en la expresión de los genes. Hay una gran variedad de modificaciones y muchas combinaciones posibles, pues todas las histonas pueden modificarse. Esto es como un lenguaje, el código de las histonas.

En todo este proceso de modificación de las histonas participan distintas proteínas:

• Los lectores son las proteínas encargadas de reconocer las modificaciones. Leen la información y según ella llevan a los escritores y a los borradores donde sean necesarios.
• Los escritores son las proteínas escritoras. Son las que añaden modificaciones a las histonas, escriben la información, guiados por los lectores.
• Los borradores se encargan de eliminar las marcas epigenéticas, también guiados por los lectores.

Actualmente se ha descifrado el significado, es decir, los efectos sobre la expresión génica, de muchos tipos de modificaciones, pero todavía quedan algunas incógnitas sin resolver. Las modificaciones más conocidas son la acetilación, la metilación, la ubiquitinación y la fosforilación.

 

Acetilación

La acetilación consiste en la adición de un grupo acilo al aminoácido lisina. El ADN tiene carga negativa debido a los grupos fosfato, por tanto se une a las histonas por la atracción entre cargas opuestas de las lisinas, que tienen carga positiva. El grupo acilo neutraliza la carga positiva de la lisina, por lo que se pierde afinidad entre el ADN y la histona con acetilaciones, lo que facilita la separación. Como consecuencia, hay una mayor accesibilidad para las enzimas implicadas en la transcripción. Así pues, la acetilación se asocia con regiones transcripcionalmente activas de la cromatina, como la eucromatina, pues promueve la transcripción de los genes.

 

Metilación

La metilación es la adición de un grupo metilo a dos posibles aminoácidos: la lisina y la arginina. En este caso, el efecto depende de la posición y del tipo de aminoácidos en las histonas en los que tenga lugar la metilación. Cuando se metilan las argininas se activa la transcripción, mientras que cuando se metilan las lisinas el efecto puede ser tanto la activación como la represión de la transcripción. La metilación de las histonas está implicada, por ejemplo, en el proceso de respuesta a daño celular.

 

Ubiquitinación

En la ubiquitinación se añade una proteína ubiquitina o una cadena de varias ubiquitinas a las histonas. Cuando se añade una sola ubiquitina (monoubiquitinación) los efectos pueden ser muy diversos. Sobre todo está implicado en la regulación de señalización celular. Por otro lado, cuando se añaden varias ubiquitinas (poliubiquitinación) se puede promover la degradación de histonas o se pueden reclutar distintas proteínas, que pueden realizar una amplia variedad de funciones.

 

Fosforilación

En la fosforilación se añade un grupo fosfato a determinados aminoácidos de las histonas, más concretamente a aquellos que tengan grupos hidroxilo. Esta modificación está implicada sobre todo en la compactación de la cromatina. Se ha observado que esos grupos fosfato pueden reclutar distintas proteínas implicadas en dicho proceso.

Ejemplos de modificaciones en las histonas. Vemos que en el caso de la acetilación y la fosforilación suele añadirse un solo grupo acilo y un solo grupo fosfato, respectivamente. En cambio, la ubiquitinación puede ser mono o poliubiquitinación, según si se añaden una o más ubiquitinas. Por otro lado, en la metilación se pueden añadir entre uno y tres grupos metilo. FIgura creada con Biorender.

Cabe destacar que las modificaciones en las histonas no actúan por libre. Existe “comunicación” entre las distintas modificaciones, haciendo que el código de las histonas sea muy complicado de descifrar. Los lectores pueden leer una determinada marca, y guiar a los escritores a que añadan otra distinta, que por su parte podría hacer que los borradores borren otra marca que había anteriormente, etc.

Finalmente, es importante quedarse con la idea de que, como las marcas epigenéticas en las histonas regulan la transcripción de los genes y tienen efectos a gran escala, pues afectan a muchos procesos fisiológicos. En algunas enfermedades, como el cáncer, se ha observado una desregulación en los procesos de modificación de histonas. Por tanto, es importante que las modificaciones sean leídas, borradas y escritas correctamente.

 

Fuentes:

Barnes CE, English DM, Cowley SM. Acetylation & Co: an expanding repertoire of histone acylations regulates chromatin and transcription. Essays Biochem. 2019 Apr 23;63(1):97-107. doi: 10.1042/EBC20180061. PMID: 30940741; PMCID: PMC6484784.

Gong F, Miller KM. Histone methylation and the DNA damage response. Mutat Res. 2019 Apr-Jun;780:37-47. doi: 10.1016/j.mrrev.2017.09.003. Epub 2017 Sep 23. PMID: 31395347; PMCID: PMC6690396.

Rothbart SB, Strahl BD. Interpreting the language of histone and DNA modifications. Biochim Biophys Acta. 2014 Aug;1839(8):627-43. doi: 10.1016/j.bbagrm.2014.03.001. Epub 2014 Mar 12. PMID: 24631868; PMCID: PMC4099259. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24631868/

Zhang T, Cooper S, Brockdorff N. The interplay of histone modifications – writers that read. EMBO Rep. 2015 Nov;16(11):1467-81. doi: 10.15252/embr.201540945. Epub 2015 Oct 15. PMID: 26474904; PMCID: PMC4641500.

Fuente: El código de las histonas: un lenguaje genético más allá del ADN

¿Cómo se fabrican las vacunas de ARN contra la COVID-19?

 PUBLICADO EL MAYO 5, 2021 POR RUBÉN MEGÍA GONZÁLEZ (COORDINADOR DEL ÁREA DE FORMACIÓN)

Rubén Megía y Amparo Tolosa

¿Sabes cómo se fabrican los objetos que te rodean? Si no has visto ningún video explicativo al respecto, seguramente te resulte difícil imaginar cómo se fabricaron la taza que te regaló tu amiga del instituto, tu vieja silla de escritorio o tu tarta preferida del supermercado. En el mundo de la genética sucede algo similar. Te pueden explicar millones de veces qué es una vacuna de ARN o cómo funciona, pero, ¿sabrías decir cómo se fabrican? Si la respuesta es no, estás de suerte, porque has llegado al post indicado.

Antes de entrar en materia, recordemos qué es una vacuna de ARN y cómo funciona.

¿Qué es una vacuna de ARN y cómo funciona?

Una vacuna es, por definición, cualquier preparación destinada a generar inmunidad. En el caso de las vacunas de ARN, el componente principal es una molécula de ARN monocatenario. Esta molécula, al ser traducida en nuestras células, produce proteínas del agente infeccioso. Las nuevas proteínas del agente infeccioso, que son inocuas para nuestro organismo, inducen una respuesta inmunitaria, con su correspondiente generación de linfocitos de memoria.

Las vacunas de ARN no son nuevas. Llevan estudiándose desde los años 90. Sin embargo, hasta noviembre del 2020, no se había aprobado ninguna. Las primeras vacunas de ARN en recibir aprobación (en este caso, aprobación de emergencia) han sido las vacunas contra la COVID-19 de Pfizer/BioNTech y Moderna. Un reciente artículo del New York Times nos cuenta cómo se producen las vacunas de ARN mensajero de Pfizer.

Paso 1. Todo empieza en el ADN

El proceso de fabricación de las vacunas de ARN comienza a partir de moléculas circulares de ADN que contienen en su interior la información para producir proteína S, una proteína de cubierta del coronavirus. Estas moléculas circulares de ADN, que son la materia prima de la vacuna, se han preparado en laboratorio utilizando plásmidos estándar a los que se ha introducido la secuencia de la proteína S mediante ingeniería genética (un proceso muy parecido a un cortapega molecular).

Los plásmidos pueden almacenarse a baja temperatura durante mucho tiempo, por lo que el primer paso de todo el proceso suele ser descongelar un vial de los que se utilizan para almacenarlos.

Paso 2. El ADN se multiplica en bacterias

Una vez descongelados los plásmidos. el siguiente paso es obtener muchos más a partir de cada uno. Para ello, se recurre a bacterias, que se dividen rápidamente y son expertas en multiplicarse.

Los científicos introducen los plásmidos en bacterias E.coli, ampliamente utilizadas en laboratorios, y las cultivan toda la noche en matraces con medio de cultivo adecuado para su crecimiento. Los matraces suelen estar la temperatura adecuada (a 37º grados las E. coli crecen muy bien) y en movimiento para que todo el cultivo esté aireado y optimizar las condiciones de crecimiento.

Posteriormente, este precultivo se añade a un tanque con hasta 300 litros de medio de cultivo, donde se favorece que las bacterias sigan dividiéndose y multiplicándose durante cuatro días. Cada bacteria tarda en torno a 20 minutos en dividirse, por lo que el resultado final son billones de bacterias, que contienen en su interior billones de plásmidos con la secuencia de la proteína S.

Paso 3. Purificación del ADN

El siguiente paso del proceso es obtener y purificar los plásmidos de ADN producidos en el cultivo bacteriano. Para ello se utilizan protocolos estándar con diferentes agentes químicos que rompen las membranas de las bacterias y permiten recuperar el ADN de los plásmidos, que es mucho más pequeño que el ADN genómico de las bacterias. A continuación, el ADN se purifica para que no queden restos del medio o de las bacterias.

Paso 4. Análisis de calidad del ADN

El ADN de los plásmidos va a ser utilizado para producir ARN en etapas posteriores por lo que es esencial que no haya contaminantes y la secuencia del fragmento que contiene la información de la proteína S no haya sufrido mutaciones durante la amplificación en las bacterias. Por lo tanto, una vez purificado el ADN se realizan diversas pruebas de calidad para confirmar que los plásmidos no han cambiado.

Los ADNs que pasan el control de calidad pueden ser introducidos en nuevas bacterias para generar más plásmidos o bien, ser utilizados en los siguientes pasos de la producción de vacunas.

Paso 5. Cortar y purificar el ADN con la secuencia de la proteína S

El siguiente paso del proceso es cortar y purificar el fragmento del plásmido que contiene la secuencia de la proteína S.  Este paso es necesario porque las vacunas de ARN solo contienen material hereditario correspondiente a la proteína S. Es decir, gran parte del plásmido no se utiliza en etapas posteriores. En esencia, solo se utilizará el ADN que codifica la proteína S.

Para realizar este paso, se añaden enzimas que cortan el ADN por los extremos de la secuencia de interés. Estas enzimas reconocen secuencias de ADN específicas y cortan la molécula circular del plásmido, de forma que se producen moléculas lineales de plásmido y del fragmento que contiene la proteína S.

Los fragmentos de ADN con la proteína S se separan del resto por filtración, de forma que el resultado final de esta etapa son botellas de un litro llenas de fragmentos de ADN con la información de la proteína S en solución. El ADN obtenido se analiza de nuevo para confirmar su calidad para los siguientes pasos.

Paso 6. Del ADN al ARN

El siguiente paso es utilizar el el ADN obtenido como patrón para producir ARN mensajero.

La solución de ADN se mezcla con enzimas y componentes del ARN. Las enzimas se encargan de abrir el ADN y utilizarlo como molde para generar un ARN mensajero de la proteína S. Este proceso lleva varias horas. La mezcla donde se produce la reacción, que contiene ADN, ARN, enzimas y componentes del ARN, se filtra posteriormente para obtener únicamente el ARN mensajero.

Paso 7. Control de calidad del ARN

Al igual que se hacía con el ADN, los científicos de Pfizer comprueban la pureza de la solución de ARN mensajero resultante del paso anterior y analizan sus secuencia para confirmar que no haya modificaciones o alteraciones.

 

Paso 8. Ensamblaje del ARN mensajero y la capa lipídica

Las vacunas de ARN mensajero son, en esencia, moléculas de ARN mensajero cubiertas con una capa de lípidos.

La mezcla de lípidos que componen la vacuna se prepara en paralelo al ARN mensajero y contiene cuatro componentes:

•         Lípidos ionizables con carga positiva que se unirán al ARNmensajero, cargado negativamente.
•         Lípidos PEGilados que contribuyen a controlar el tamaño y estabilidad de las partículas víricas y
•         Lípido neutral que contribuyen a que se forme la estructura
•         Colesterol, que ayuda en la formación de la estructura de la vacuna.

 

Para mezclar la solución de ARN mensajero con la de lípidos en la proporción correcta, se utilizan diferentes bombas, que controlan el flujo de los componentes y su interacción. Cuando los lípidos interaccionan con el ARN mensajero, cargado negativamente, se unen al mismo formando dos capas a su alrededor, que protegen el ARN del exterior.

A continuación, las partículas de vacunas se filtran de nuevo para eliminar cualquier impureza, como por ejemplo el etanol que se utiliza para mezclar la solución de lípidos.   

Paso 9. Preparación de las vacunas en los viales

Una vez preparada la solución de la vacuna, se rellena con ella los viales en los que se distribuirá. Cada vial contiene 0.45 mililitros de solución de vacuna, que tras ser diluida podrá ser utilizada en 6 dosis. Estos viales son lavados y esterilizados previamente y deben pasar diferentes pruebas de calidad para garantizar que no tienen imperfecciones que comprometan su integridad o la efectividad de la vacuna, ni fugas.

El vertido de la vacuna en los viales debe realizarse rápidamente para evitar la degradación del ARN mensajero. Una vez rellenados los viales se evalúa de nuevo que estén intactos. A continuación se etiquetan, se ponen en bandejas con capacidad de 195 viales cada una y se congelan a -70 grados centígrados en congeladores que garantizan esta temperatura en todo su interior.

Paso 10. Empaquetado y Envío

Con la vacuna preparada en los viales, el siguiente paso es empaquetarlos para su distribución a cualquier parte del mundo. En este proceso el mantenimiento de la cadena de frío es vital para garantizar que la vacuna mantiene su efectividad.

Las bandejas de 195 viales se pueden empaquetar de cinco en cinco en cajas con hielo seco que mantienen el frío durante el tiempo suficiente hasta que lleguen a su destino y puedan ser almacenadas o utilizadas.

En total, el proceso de producción de la vacuna lleva 60 días.

Todos los pasos de la vacuna no se realizan en las mismas instalaciones. Por ejemplo, en EE.UU. la producción y purificación de los plásmidos de ADN se lleva a cabo en las instalaciones de Pfizer de Chesterfield. Desde ahí, se envían botellas de ADN congelado a las instalaciones de Andover en Massachusetts o Mainz en Alemania, donde se obtiene el ARN mensajero, que a su vez es enviado congelado a otras instalaciones donde se prepara la vacuna final.

Bibliografía

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378517321003914

https://www.pfizer.com/science/coronavirus/vaccine/manufacturing-and-distribution

https://www.nytimes.com/interactive/2021/health/pfizer-coronavirus-vaccine.html?fbclid=IwAR3K-6nZty6uGMwgZGl5T6Va4dtwcI_o6fy7kOcerk9Y7DDq35yuRmAzyfI

https://www.comirnatyeducation.es/files/Comirnaty_PIL_Spain.pdf

Fuente: ¿Cómo se fabrican las vacunas de ARN contra la COVID-19?